PEMBUATAN PREPARAT MITOSIS Alium cepa DENGAN METODE SQUASH

1.    Penumbuhan akar Alium cepa

 2.    Prosedur fiksasi akar Alium cepa  

3.    Prosedur pembuatan preparat

Ada beberapa tahapan penting dalam pembuatan preparat ujung akar Alium cepa dengan metode squash ini, yaitu penumbuhan akar Alium cepa, fiksasi akar Alium cepa, maserasi, pewarnaan, dan pembuatan preparat ujung akar Alium cepa. Berikut merupakan pembahasan dari masing-masing tahapan :

1.      Penumbuhan akar Alium cepa

Pada proses penyiapan ini bawang merah yang digunakan merupakan bawang merah yang sudah mengalami dormansi, sehingga secara fisiologis ia sudah siap untuk mulai bertunas jika ditumbuhkan pada media tertentu. Pemilihan media tumbuh yakni air memiliki beberapa pertimbangan tertentu berdasarkan keuntungan akhir yang akan didapatkan. Praktikan menggunakan air sebagai media tumbuh karena dengan menggunakan air maka akar yang dihasilkan akan menjadi lurus dan diameter akar yang akan didapat relative berukuran lebih besar. Bentuk akar yang lurus akan memudahkan waktu pengamatan karena biasanya sel-selnya akan berjajar dengan rapid dan diameter akar yang besar otomatis akan memiliki kapasitas yang lebih untuk menampung sel dalam jumlah yang relatif lebih banyak, sehingga akan memudahkan mata praktikan dalam mengamati sel-sel yang sedang mengalami proses mitosis.

2.      Fiksasi akar Alium cepa

Prosedur pertama untuk fiksasai adalah pemotongan ujung akar sepanjang kurang lebih 1 cm. Kemudian dimasukkan ke dalam botol vlakon yang bersi fiksatif yang terdiri dari asam asetat dan alkohol absolut dengan perbandingan 1:3. Penggunanan asam asetat dan juga alkohol absolut merupakan langkah fiksatif untuk bisa menghentikan aktivitas seluler dan mengawetkan proses yang terjadi ketika ujung akar tersebut dipotong. Dengan demikian proses mitosis yang mungkin terjadi pada waktu pemotongan dapat dijebak dalam keadaan terfiksatif sehingga nanti pada saat pengamatan preparat yang sudah selesai di bawah mikroskop akan menunjukkan aktivitas sel-sel  meristem ujung akar.

Rendaman ujung akar Alium cepa dengan fikastif ini kemudian ditempatkan dalam freezer selama minimal 24 jam. Penempatan ujung akar yang sudah terendam di dalam refrigerator adalah untuk memantapkan proses fiksasi, karena mungkin saja dengan perbandingan 3 : 1 masing-masing untuk alkohol absolut dan asam asetat pekat belum begitu kuat untuk memfiksasi jaringan yang ada, sehingga dengan menggunakan bantuan temperatur ruang yang rendah, yakni 5-6 ^oC maka dapat ikut menekan aktivitas seluler yang ada karena suhu yang relative rendah biasanya mampu menggiring tumbuhan untuk melakukan aktivitas dormansi, dengan kata lain proses metabolisme lambat laun akan terhenti.

3.      Maserasi

Setelah rendaman ujung akar Alium cepa dengan fiksatif dikeluarkan dari dalam freezer, langkah selanjutnya adalah pencucian ujung akar terfiksatif dengan menggunakan air sebanyak 3x. Hal ini selain bertujuan untuk membersihkan larutan fiksatif yang ada (karena dikhawatirkan kandungan larutan fiksatif yang terlampau banyak dapat mengganggu proses pewarnaan dengan acetocarmin pada proses selanjutnya) setidaknya juga untuk memberikan perlakuan khusus pada ujung akar tersebut setelah mendapat perlakuan pada suhu rendah, agar nantinya pada waktu pemanasan tidak terjadi shock-temperatur yang terlampau hebat sehingga bisa menghancurkan akar secara fisik.

Setelah pencucian selesai, proses selanjutnya adalah maserasi. Dalam proses maserasi ini ujung akar Alium cepa diberi HCl 1 N hingga potongan ujung akar bawang merah yang ada terendam sepenuhnya dalam HCl 1 N, proses ini bertujuan untuk melakukan proses maserasi pada sel-sel meristem apikal akar bawang merah. Maserasi merupakan suatu treatmen yang dilakukan untuk memisahkan sel yang satu dengan sel yang lain dengan cara melarutkan pektin, selulosa, dan kandungan sel lain yang menyebabkan sel tersebut kuat. Sehingga pada akhirnya dengan proses maserasi, jaringan akan menjadi lunak dan diharapkan akan menjadi selapis saja, karena akan mempermudah proses pengamatan tahapan pembelahan mitosis yang mungkin berhasil terfiksasi. HCl merupakan asam yang cukup kuat untuk membuat hal ini mungkin untuk terjadi.

Dan untuk mempercepat terjadinya proses maserasi berbantuan larutan HCl 1 N ini maka setelah proses ini dilanjutkan dengan proses pemanasan potongan ujung akar pada penangas air, pada suhu 55^oC – 60^oC selama kurun waktu 8 menit, akan tetapi pada prakteknya pada suhu 50^oC maka proses pemanasan sudah mulai dilakukan hal ini semata-mata untuk efisiensi waktu. Suhu dijaga jangan sampai melebihi 60⁰C karena jaringan yang sudah setengah lunak dengan keberadaan HCl akan mudah hancur pada suhu di atas 60^oC. Pemanasan dilakukan untuk membantu mempercepat proses reaksi pelunakan yang menggunakan HCl 1 N ini akan berlangsung lebih cepat, karena sudah kita ketahui bahwa peningkatan suhu akan berbanding lurus dengan peningkatan kecepatan reaksi.

Setelah proses pemanasan di dalam penangas air selesai, potongan ujung akar bawang merah kita cuci di dalam petridish sebanyak 3x untuk menghilangkan sisa-sisa HCL yang ada, karena diketahui bahwa konsentrasi akan struktur serta fungsionalitas dari   acetocarmin mudah terganggu dengan adanya zat-zat asam kuat lemah atau pun kuat (dan mungkin juga senyawa yang bersifat basa), sehingga semua sisa HCl harus benar-benar dibuang.

4.      Pewarnaan

Proses selanjutnya setelah pencucian selesai adalah pewarnaan dengan menggunakan acetocarmin. Dalm proses pewarnaan ini,  kumpulan potongan ujung akar ditempatkan pada salah satu sisi dari petridish. Hal ini untuk melakukan langkah efisiensi penggunaan pewarna ini, karena acetocarmin adalah senyawa pewarna untuk kromosom yang bukan merupakan barang ekonomis sehingga penggunaannya pun  harus seefisien mungkin. Proses pewarnaan ini memakan waktu  ± 5 menit agar seluruh jaringan terwarnai dengan sempurna.

Proses selanjutnya ketika pewarnaan ini selesai adalah pencucian potongan ujung akar. Prosedur pencucian pada tahap ini sama dengan prosedur pencucian pada langkah sebelumnya, yakni dicuci sebanyak 3x dan tetap di dalam petridish dan menggunakan pipet tetes.

5.      Pembuatan Preparat

Langakh berikutnya setelah pencucian dari pewarnaan adalah pembuatan preparat ujung akar Alium cepa yang tepat merupakan daerah pembelahan. Dengan menggunakan kuas yang telah dibasahi terlebih dahulu, sebuah potongan ujung akar dipindahkan ke atas gelas benda, kemudian dengan menggunakan silet, ujung dari potongan ujung akar ini dipotong sepanjang ujung akar yang berwarna paling ungu atau paling gelap warnanya jika dibandingkan dengan bagian ujung akar yang lain. Pemilihan bagian ujung yang memiliki wrna paling ungu atau paling gelap ini untuk dipotong adalah karena pada ujung dari akar tersebut terdapat meristem apikal, yang sebagaimana telah diketahui tempat terjadinya pembelahan meristematik aktif (pembelahan mitosis).

Setelah pemotongan selesai, gelas penutup ditempatkan di atas obyek (potongan ujung akar), kemudian secara hati-hati dengan menggunakan ujung kuku untuk menekan potongan ujung akar tersebut sehingga pada nantinya akan meratakan sel-sel meristem ujung akar tersebut hingga terpisah satu dengan yang lainnya sehingga akan mempermudah proses pengamatan praktikan.  

Setelah melalui beberapa tahapan metode squash tersebut, maka preparat sudah siap untuk dimati di bawah mikroskop. Preparat yang sudah selesai dibuat ini secepatnya harus diamati, karena sel ataupun jaringan yang sudah mengalami berbagai perlakuan seperti yang telah dilakukan tersebut, akan cepat sekali mengalami kerusakan, sehingga harus segera diamati adakah proses mitosis pada preparat ujung akar tersebut. Pengmatan yang dilakukan praktikan adalah melihat tahapan-tahapan pembelahan mitosis. Kemudian melakukan dokumentasi dengan pemotretan setelah mendapatkan tahapan pembelahan mitosis pada preparat.